La straordinaria biodiversità di lieviti e batteri lattici autoctoni del pane toscano DOP

di Monica Agnolucci e Michela Palla

Il sapore, i profumi e gli aromi del pane toscano DOP, insieme ad altre sue peculiari caratteristiche organolettiche, nutrizionali e salutistiche, potrebbero dipendere in larga misura dalla complessa struttura delle comunità di microrganismi agenti della fermentazione.
La DOP, denominazione di origine protetta, è stata conferita al pane toscano ottenuto mediante l’esclusivo impiego sia di farine di grano tenero tipo “0”, contenenti il germe di grano e prodotte da varietà di frumento coltivate, stoccate e molite in Toscana, sia del lievito madre (o lievito naturale, impasto acido). Tale lievito madre (in inglese "sourdough”), rappresentato da una porzione di impasto proveniente da una precedente lavorazione, è in grado di avviare la lievitazione grazie al complesso sistema biologico costituito da lieviti e batteri lattici. Diversi studi effettuati in tutto il mondo hanno da tempo dimostrato che l’utilizzazione del lievito madre conferisce caratteristiche sensoriali e nutritive uniche al pane, incrementandone aroma e gusto, migliorandone il volume e la consistenza, prolungando la sua shelf-life, e aumentando il suo valore nutrizionale e nutraceutico.
In ogni lievito madre utilizzato per la produzione dei vari pani e prodotti da forno tipici, tra cui il pane di San Francisco, il pane di Altamura, il pane toscano, insieme a panettone e pandoro, si sviluppano popolazioni di microrganismi peculiari, in relazione al processo di produzione (temperatura, pH, modalità dei rinfreschi), al tipo di farina utilizzato e alle diverse condizioni ambientali. Per questo ogni lievito madre è strettamente legato all’area geografica di origine, al territorio in cui viene prodotto. In generale, i lieviti che più comunemente sono stati identificati in vari tipi di lievito madre appartengono alle specie Saccharomyces cerevisiae, Kazachstania exigua, Kazachstania humilis, Yarrowia keelungensis e Torulaspora delbrueckii, mentre i batteri lattici appartengono al genere Lactobacillus, come le specie L. plantarum, L. brevis, L. sanfranciscensis, L. fermentum, L. curvatus e L. sakei. È importante sottolineare che alcune delle specie di batteri lattici vivono in una stretta associazione metabolica con particolari specie di lieviti; per esempio L. sanfranciscensis (così chiamato perché fu isolato per la prima volta dal pane di San Francisco), che rappresenta la specie batterica predominante nel lievito madre, fermenta in maniera molto efficiente il maltosio contenuto nelle farine e si trova spesso in simbiosi con le specie di lievito incapaci di utilizzare il maltosio, come K. humilis e K. exigua. L’utilizzazione di tecniche microbiologiche classiche ha permesso di isolare i microrganismi fermentanti vitali e coltivabili e la loro identificazione a livello di genere e specie ha confermato la grande diversità del microbiota presente nel lievito madre impiegato per la produzione dei vari tipi di pane, dal pane francese al cornetto di Matera, dal pane di Altamura ai diversi pani prodotti in Abruzzo, Marche, Sardegna, Sicilia.  
Il lievito madre del pane toscano DOP è stato per la prima volta caratterizzato a livello di genere e specie nei nostri laboratori dell’Università di Pisa, nel 2017, utilizzando sia tecniche classiche coltura-dipendenti che tecniche molecolari coltura-indipendenti. L’analisi di 96 isolati di batteri lattici e di 68 isolati di lieviti ha permesso di identificare le specie dominanti, rappresentate da una peculiare associazione tripartita di K. humilis, S. cerevisiae e L. sanfranciscensis.  Inoltre, questo studio ha evidenziato una interessante diversità intraspecifica in L. sanfranciscensis, rivelando che 18 dei 96 isolati mostravano attività fitasica, erano cioè capaci di operare la scissione del legame che si instaura tra l’acido fitico e i minerali chelati come calcio, ferro, magnesio e zinco, che sono resi nuovamente biodisponibili.
Tale diversità intraspecifica è stata indagata in successive ricerche, i cui risultati sono stati recentemente pubblicati. Sono stati analizzati 96 diversi ceppi della specie L. sanfranciscensis, 65 di K. humilis e 3 di S. cerevisiae isolati dal lievito madre del pane toscano DOP. Diverse tecniche molecolari sono state preliminarmente utilizzate per identificare quelle capaci di discriminare in maniera ottimale i vari ceppi di batteri lattici e lieviti. La tecnica RAPD-PCR eseguita usando 3 diversi primers ha permesso di discriminare 43 biotipi di L. sanfranciscensis tra i 96 saggiati, rivelando una inaspettata biodiversità tra i ceppi caratterizzanti il lievito madre del pane toscano DOP. La tecnica rep-PCR usando il primer (GTG)5 ha mostrato la presenza di 9 biotipi tra i 65 isolati di K. humilis, mentre l’amplificazione della regione inter-delta è stata usata per tipizzare gli isolati di S. cerevisiae.
La straordinaria biodiversità intraspecifica dei principali microrganismi presenti nel lievito madre del pane Toscano DOP rivelata dal nostro studio mette in evidenza la complessa struttura del suo microbiota, le cui specifiche proprietà funzionali possono essere responsabili della produzione di peculiari composti bioattivi capaci di conferire al pane aromi unici e di aumentarne la qualità nutrizionale e nutraceutica. Test qualitativi hanno mostrato la capacità di solubilizzare i fitati in 18 ceppi di L. sanfranciscensis, in 3 di S. cerevisiae e in 4 di K. humilis. Tra i 65 isolati appartenenti a quest’ultima specie il 50% mostrava attività proteasica che permette la riduzione del glutine e quindi una maggiore tolleranza da parte dei soggetti gluten-sensitive.
 In conclusione, il nostro lavoro dimostra che la caratterizzazione molecolare e funzionale a livello di ceppo del microbiota del lievito madre rappresenta una tappa fondamentale non solo al fine di conferire valore aggiunto al prodotto, ma anche per selezionare lieviti e batteri lattici autoctoni da utilizzare come colture starters innovative e per progettare nuovi alimenti funzionali.

Approfondimento:
Michela Palla, Caterina Cristani, Manuela Giovannetti, Monica Agnolucci (2020). Large Genetic Intraspecific Diversity of Autochthonous Lactic Acid Bacteria and Yeasts Isolated from PDO Tuscan Bread Sourdough. Applied Sciences, 10, 1043 doi:10.3390/app10031043
https://www.mdpi.com/2076-3417/10/3/1043