Produzione di anticorpi monoclonali su larga scala? Il futuro è delle piante *

Gli anticorpi monoclonali (mAb) sono biomolecole molto utili in medicina, biologia e biochimica per la loro capacità di legarsi specificamente e stabilmente a diversi target molecolari sia in vivo che in vitro.  Attualmente, i processi per la loro produzione su larga scala si basano sull’impiego di colture di cellule di mammifero che richiedono investimenti iniziali e costi di produzione piuttosto elevati, così come alti sono i costi operativi e di manutenzione (Ecker et al. 2015).
Tra i sistemi alternativi di espressione, le piante sono “bioreattori” promettenti per la produzione su larga scala di anticorpi ricombinanti perché offrono una piattaforma di espressione che presenta numerosi vantaggi come l’assenza di potenziali patogeni umani, la possibilità di progettare un profilo anticorpale su misura, la possibilità di produrre su scala industriale e la competitività dei costi di produzione.  Nonostante i costi di produzione siano stati stimati intorno ai 100 €/g (Buyel et al. 2017), assolutamente paragonabili ai costi medi in cellule di mammifero che vanno da 50 a 100 €/g (Lim et al. 2010; Kelley 2009), di contro l'espressione delle proteine ricombinanti nelle piante presenta ancora alcune criticità, principalmente correlate ai processi di purificazione e a questioni normative (Fischer et al. 2015; Drake et al. 2017).  Fino ad oggi, un'ampia gamma di proteine ricombinanti come anticorpi, enzimi e vaccini è stata prodotta utilizzando sistemi di espressione basati su piante dimostrando la loro efficacia e sicurezza in studi preclinici e clinici (Yao et al. 2015).  Ma quali sono le principali differenze tra le glicoproteine prodotte in piante e quelle prodotte in cellule di mammifero? E quali sono le più recenti tecnologie per la produzione di anticorpi monoclonali in sistemi alternativi?

Glicoproteine di origine vegetale 
Le modificazioni post-traduzionali delle proteine che si verificano nelle cellule vegetali sono essenzialmente simili a quelle che avvengono nelle cellule animali ed il corretto assemblaggio di molecole complesse, come gli anticorpi, è guidato da “accompagnatori molecolari” (chaperons) che mediano il ripiegamento e la formazione dei legami disolfuro, mentre l'aggiunta di zuccheri (N-glicani) viene eseguita da specifiche glicosiltransferasi cellulari.  Proprio gli N-glicani rappresentano le differenze più significative tra le glicoproteine di origine vegetale e quelle di origine animale e sono considerati un potenziale problema nella terapia umana per possibili reazioni immunitarie avverse (Jin et al. 2008).   La potenziale immunogenicità dei residui di zucchero, tipici delle piante, resta ancora un tema controverso anche se, finora, gli studi clinici condotti su glicoproteine di origine vegetale non hanno mai evidenziato effetti negativi sull'uomo (Tusé et al. 2015).  Tuttavia, per ovviare a possibili vincoli normativi sulla biosicurezza, questo problema è stato risolto ottimizzando il profilo di N-glicosilazione delle molecole di origine vegetale attraverso strategie diverse come l'inattivazione delle glicosiltransferasi endogene specifiche della pianta e/o la loro complementarietà con glicosiltransferasi umane eterologhe (Steinkellner e Castilho 2015; Montero-Morales e Steinkellner 2018).  È interessante inoltre notare come, in molti casi, gli anticorpi monoclonali prodotti in sistemi di piante ingegnerizzate abbiano mostrato un'attività biologica addirittura migliorata rispetto a quelli ottenuti in cellule animali (Marusic et al. 2018; Qiu et al. 2014).  Complessivamente, i recenti progressi dell’ingegneria genetica delle piante hanno permesso la produzione di glicoproteine ricombinanti simili a quelle umane con un profilo di glicosilazione altamente omogeneo tanto da considerare i sistemi di espressione in pianta piattaforme versatili per la produzione di mAb con caratteristiche spesso migliori.

Produzione di mAb in pianta
Il primo studio pionieristico sulla produzione di IgG nelle piante risale a quasi 30 anni fa (Hiatt et al.  1989).  Da allora diversi anticorpi sono stati espressi con successo in pianta con scopi diversi come conferire resistenza ai virus, modulare i processi biosintetici in cellule vegetali o produrre preziosi biofarmaci tra cui mAb terapeutici (Lomonossoff e D’Aoust 2016).  Tra le difficoltà nella produzione di proteine farmaceutiche in pianta vi è la necessità di considerare l'impatto ambientale e la conformità alle normative che spesso richiedono condizioni controllate (serre a contenimento) e questo è senza dubbio un grosso limite nel rapporto costi/benefici poiché riduce notevolmente il potenziale di crescita rispetto alla coltivazione in campo.

Piante transgeniche
Diverse specie vegetali possono essere ingegnerizzate in modo efficiente per la produzione di mAb come Nicotiana benthamiana, una specie selvatica parente del tabacco, Arabidopsis thaliana, la lattuga, la patata e il mais, ma la maggior parte degli anticorpi riportati in letteratura sono stati espressi in tabacco transgenico (Nicotiana tabacum), raggiungendo generalmente livelli di diversi mg/kg (Yusibov et al. 2016).  Una strategia alternativa particolarmente interessante è rappresentata dalla produzione e accumulo di proteine ricombinanti nei semi, un compartimento naturale di conservazione delle piante che presenta numerosi vantaggi tra cui la riduzione dei contaminanti vegetali normalmente presenti nelle foglie (alcaloidi, composti fenolici, etc.) e la possibilità di migliorare la stabilità proteica a lungo termine senza la necessità di conservare il materiale vegetale a basse temperature (Boothe et al. 2010).  Un esempio interessante di questa strategia è rappresentata dall'espressione dell'anticorpo neutralizzante anti-HIV-1 2G12 in semi di mais transgenico che ha permesso di ottenere una resa di ben 75 mg/kg di peso secco di semi (Rademacher et al. 2008).

Sistemi di espressione transiente basati sulla tecnologia di agro-infiltrazione
La trasformazione transiente differisce dalla trasformazione stabile poiché la sequenza esogena non è ereditata dalla discendenza, riducendo così l’impatto ambientale (biosicurezza) legato alla diffusione del transgene attraverso semi o polline.  Inoltre, rispetto ad una trasformazione stabile, questo approccio fornisce elevate rese proteiche in tempi brevi da pochi giorni a qualche settimana (Komarova et al. 2010).  Questa metodologia nota come agro-infiltrazione, sfrutta la capacità di A.  tumefaciens di trasferire il T-DNA recante il gene d’interesse nelle cellule vegetali e si basa sulla permeazione della soluzione contenente l’agrobatterio negli spazi intercellulari delle foglie (Chen e Lai 2015).  Poiché l'agrobatterio infetta contemporaneamente quasi il 100% delle cellule nelle foglie infiltrate, questo metodo fornisce un’espressione genica sincrona.  Un ulteriore vantaggio di questa tecnologia è rappresentato dalla rapida scalabilità del processo che offre la possibilità di gestire un gran numero di piante utilizzando sistemi di infiltrazione sotto vuoto, automatizzati e su larga scala (Chen et al. 2013).

Produzione in cellule vegetali e colture di tessuti
Le colture di cellule e tessuti vegetali rappresentano un sistema valido per la produzione di proteine eterologhe grazie alla possibilità di produrre in condizioni di sterilità e con un basso rischio di contaminazione da parte di agenti patogeni umani (Schillberg et al. 2013).
Inoltre, le cellule e gli organi vegetali trasformati possono essere propagati indefinitamente e la proteina di interesse può essere secreta nel mezzo colturale permettendone un facile recupero ed una facile purificazione (Magy et al. 2014).  Tra i più promettenti sistemi di coltura cellulare e tissutale, con le migliori prospettive future per la produzione di biofarmaci, troviamo le colture in sospensione di cellule vegetali, le colture di ‘Radici pelose’ (‘Hairy roots’), le colture di muschi e microalghe.

Colture in sospensione di cellule vegetali
Le linee cellulari vegetali più utilizzate derivano da Nicotiana tabacum, altre provengono da specie commestibili come riso, soia, carota e pomodoro (Santos et al. 2016; Xu e Zhang 2014).  Il punto debole di questo sistema è la bassa resa (pochi mg/l di cultura) influenzata anche dall'attività proteolitica presente nel mezzo di coltura (Magy et al. 2014).  Tra i vantaggi, non trascurabile è la possibilità di ottimizzare il profilo di glicosilazione delle proteine ingegnerizzando il metabolismo dei glicani per produrre anticorpi con un profilo di glicosilazione simile a quello umano (Mercx et al. 2017; Navarre et al. 2017).

Coltura di radici pelose
Tra i tessuti vegetali coltivati, le colture di radici pelose (Hairy Roots-HR) rappresentano un'interessante e innovativa piattaforma per la produzione di proteine eterologhe.  Le radici pelose sono tessuti neoplastici che, nelle specie vegetali, originano dopo un’infezione con Agrobacterium rhizogenes o, più correttamente, Rhizobium rhizogenes.   Questo batterio del suolo ha la capacità di introdurre nel genoma della pianta un segmento di T-DNA dal suo plasmide (Ri) induttore di crescita radicale (White et al.  1985), che trasporta una serie di oncogeni che promuovono la formazione di HR i quali sono in grado di crescere stabilmente in colture sterili, anche per diversi anni.  Pertanto, le radici pelose offrono numerosi vantaggi come la stabilità genetica, la crescita in condizioni di sterilità, l'accumulo rapido di biomassa e la possibilità di secernere le proteine eterologhe nel terreno di coltura.  Purtroppo le basse rese proteiche, dell’ordine di mg/l di coltura, e le difficoltà nell'impostare la produzione su larga scala in bioreattori per il momento rappresentano le principali difficoltà per un loro sfruttamento su scala industriale.

Colture di muschi
Queste colture stanno riscuotendo un crescente interesse come nuovo sistema per la produzione di biofarmaci (Decker et al. 2014).  Le proteine ricombinanti possono essere secrete nel terreno di coltura semplificando il processo di purificazione.  Il muschio Physcomitrella è stato ampiamente utilizzato per la produzione di diverse classi di biofarmaci principalmente per la sua quasi completa caratterizzazione genetica che lo rende un organismo ideale da utilizzare poiché può essere modificato geneticamente in maniera mirata tramite ricombinazione omologa.  Tali metodiche hanno permesso la glico-ingegnerizzazione dei muschi per eliminare i residui potenzialmente immunogenici, portando alla produzione di proteine terapeutiche sicure.

Colture di microalghe
Anche le microalghe possono essere sfruttate per la produzione di proteine ricombinanti.  I principali vantaggi delle alghe sono il loro alto tasso di crescita e il rapido accumulo di biomassa, la facilità di coltivazione in bioreattori di dimensioni contenute e la loro capacità di effettuare modificazioni post-traduzionali di proteine come la glicosilazione.  Il primo esempio di espressione di una molecola di anticorpo ricombinante è stato ottenuto in cloroplasti di Chlamydomonas reinhardtii in cui un anticorpo funzionale a catena singola (HSV8-lsc), diretto contro la glicoproteina D del virus dell'herpes simplex, si accumulava nella sua forma funzionale (Mayfield et al. 2003).  Inoltre, recentemente, la diatomea Phaeodactylum.  tricornutum è stata modificata per esprimere un mAb completo diretto contro l'antigene di superficie del virus dell'epatite B (HBsAg), secreto o trattenuto nel reticolo endoplasmatico (Hempel e Maier 2012; Vanier et al. 2018).  Questi esempi mostrano il potenziale delle microalghe nella produzione di anticorpi completamente assemblati e funzionali, purtroppo il principale svantaggio di questo sistema è rappresentato dalle rese di produzione molto basse rispetto all’espressione transiente che utilizza piante intere.

Conclusioni e scenari futuri
Passando in rassegna i diversi scenari offerti dalle piattaforme di produzione vegetali di biomolecole, le varie strategie hanno dimostrato numerosi vantaggi anche nello sviluppo di nuovi farmaci, alcuni dei quali già approvati per la terapia nell’uomo.
Gli esempi riportati si basano sulle caratteristiche peculiari delle diverse piattaforme vegetale che, in alcuni casi, possono anche essere migliori rispetto ai tradizionali sistemi basati su cellule animali.   Ad esempio, i sistemi di espressione transiente basati sulla tecnologia dell’agro-infiltrazione che, grazie alla loro flessibilità produttiva e ai tempi rapidi di produzione, si sono dimostrati particolarmente adatti alla preparazione di vaccini.
Il primo farmaco prodotto da cellule vegetali a ricevere l'approvazione per uso umano da parte dell’Agenzia Americana del Farmaco (FDA) nel 2012 (Mor 2015) è stato L’ELELYSOTM, sviluppato da cellule di carota per trattare una rara malattia metabolica umana, la malattia di Gaucher e messo a punto dalla ditta israeliana Protalix Biotherapeutics Inc.  Esso è risultato addirittura qualitativamente superiore rispetto all'equivalente ottenuto in cellule animali.  Questo risultato ha incoraggiato altre aziende ad investire in impianti di produzione basati sul sistema ‘pianta biofabbrica’ come, ad esempio, la Medicago Inc.  (società biofarmaceutica con sede in Canada) che ha già superato la fase III dei ‘trials’ clinici per un vaccino antinfluenzale stagionale quadrivalente (Pillet et al. 2016).  E ancora, nel caso degli anticorpi immunoterapeutici dove l'uso di piante ingegnerizzare nel profilo di glicosilazione ha permesso la produzione di mAb con una migliorata attività biologica rispetto a quelli derivati dai mammiferi.  Infine, dal punto di vista economico, con oltre 50 mAb attualmente approvati per la terapia umana e con una previsione di vendita al 2020 vicina ai 125 miliardi di dollari (Shukla et al. 2017; Ecker et al. 2015), queste biomolecole rappresentano i biofarmaci di maggior successo sul mercato sia nella diagnostica che nella terapia, con una domanda che ha già raggiunto diverse tonnellate annue ed è in continua crescita.  Pertanto, i futuri scenari lasciano prevedere una richiesta dell’ordine di alcune centinaia di tonnellate all'anno, in particolare di biofarmaci per il trattamento delle malattie più diffuse quali il morbo di Alzheimer, l’HIV, l’artrite reumatoide e così via.  Trovare un modo conveniente per produrre queste molecole su larga scala diventa un imperativo e puntare su sistemi alternativi basati sull’uso di piante, rappresenta una buona strategia produttiva che nell’immediato si affianca ai di produzione tradizionali basati su cellule animali  ma che, in un prossimo futuro, potrà addirittura sostituirli.

* Estratto da: Donini, M., & Marusic C.  (2019).   Current state-of-the-art in plant-based antibody production systems.  Biotechnology Letters.  41, 335-346.

Pubblicazione integrale (SCARICA PDF) - Current-stateoftheart-in-plantbased-antibody-production-systems2019Donini_Marusic.pdf